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small RNA測(ce)序是生命活動重要的調控(kong)因子,在(zai)基因表達調控(kong)、生物個(ge)體發(fa)育、代謝及(ji)疾病的發(fa)生等生理(li)過程中起著重要的作用(yong)。Illumina能夠對細胞(bao)或者(zhe)組(zu)織中的全(quan)部Small RNA進(jin)行深度測(ce)序及(ji)定量分析(xi)等研(yan)究。

miRNA鑒定

miRNA轉(zhuan)錄ji)鶚嘉壞愣轡揮諢蚣涓羥 諍han)子以(yi)及(ji)編碼序列的反向互補序列上,其前體具有標(biao)志性的發(fa)夾(jia)結構,成熟體的形(xing)成是由Dicer/DCL黴的剪切實現的。對于已知(zhi)miRNA的鑒定,我(wo)們將比對上參(can)考基因組(zu)的reads序列與(yu)已知(zhi)miRNA數據庫(ku)miRBase(v21)中的成熟miRNA序列進(jin)行比對。針對miRNA的生物特(te)征(zheng),對于未鑒定到已知(zhi)miRNA的序列,百邁客利用(yong)miRDeep2軟件進(jin)行新miRNA的預測(ce)。

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基因表達水平(ping)分析(xi)

利用(yong)轉(zhuan)錄組(zu)數據檢測(ce)基因表達具有較高的靈(ling)敏度。通過FPKM密度圖和箱線圖不僅可以(yi)反映單個(ge)樣品基因表達水平(ping)分布和離散程度,還(huai)可以(yi)直觀的比較不同樣品的整體基因表達水平(ping)差(cha)異(yi)。

差(cha)異(yi)表達miRNA聚類分析(xi)

聚類分析(xi)用(yong)于判斷差(cha)異(yi)基因在(zai)不同實驗條件下(xia)的表達模式,可通過將表達模式相同或相近(jin)的基因聚集成類,從而識(shi)別(bie)未知(zhi)基因的功能或已知(zhi)基因的未知(zhi)功能,同類基因可能具有相似的功能或共同參(can)與(yu)同一(yi)代謝huai)獺6隕稈﹞齙牟cha)異(yi)表達miRNA做(zuo)層次聚類分析(xi),將具有相同或相似表達行xing) iRNA進(jin)行聚類。

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差(cha)異(yi)miRNA靶(ba)基因注釋

生物體內,在(zai)特(te)定條件下(xia)某些基因對應的轉(zhuan)錄本會形(xing)成miRNA前體,失去(qu)編碼功能,從而影響生物學表型。因此(ci),針對miRNA的靶(ba)基因分別(bie)進(jin)行GO和KEGG注釋及(ji)an)患 治xi),有助于深入挖掘小RNA功能。

Q1. 動植can)鐫zai)miRNA預測(ce)中有什麼差(cha)別(bie)︰

答︰植can)iRNA可與(yu)mRNA的編碼區完全(quan)互補配對,並(bing)通過誘導mRNA降解而發(fa)揮抑(yi)zhong)票澩 淖饔yong),我(wo)們可以(yi)直接通過比對來篩選靶(ba)基因
動物miRNA則可與(yu)mRNA的3’UTR區部分互補配對結合,進(jin)而抑(yi)zhong)品 氳慕jin)行,一(yi)般的,miRNA與(yu)mRNA的配對區域(yu)位于miRNA的5’端的 2-8個(ge)堿基,稱為種(zhong)子區,只要種(zhong)子區能與(yu)mRNA互補配對即可發(fa)揮作用(yong),這也是一(yi)個(ge)miNRA能夠調控(kong)數百條mRNA的原因。
?對于動物預測(ce)靶(ba)基因我(wo)們不是直接通過比對進(jin)行篩選的。
?在(zai)動物預測(ce)時bao) 捎諼wo)們沒(mei)法給(gei)出3‘utr區,因此(ci)我(wo)們截取mRNA5’端前2000bp使(shi)用(yong)動物預測(ce)靶(ba)基因方法進(jin)行預測(ce),target_length指的就(jiu)是我(wo)們截取該mei)虻某?取/p>

Q2. 分析(xi)結果中如(ru)何確定miRNA對應的pre-miRNA的數量(別(bie)人論文中有這樣的結論︰We identified 83 potential novel miRNAs, which corresponded to 95 genomic loci.)?

答︰文獻(xian)中的描述(shu)是指某些成熟的miRNA序列可能來自于不同的miRNA前體序列,無參(can)項目(mu)中分析(xi)的novel miRNA是針對每個(ge)Unigene分析(xi)的,命名(ming)也是與(yu)Unigene對應,沒(mei)有對成熟miRNA的序列進(jin)行重復(fu)的分析(xi)。對成熟的miRNA的序列進(jin)行去(qu)重復(fu)統計(ji),例如(ru)某項目(mu)預測(ce)出了229個(ge)miRNA,其中有6個(ge)miRNA分別(bie)來自于兩個(ge)不同的前體序列,故可表述(shu)為︰預測(ce)出了223個(ge)miRNA,對應了229個(ge)前體序列。

Q3. 目(mu)前對于小RNA靶(ba)基因的結果驗證方法有哪些?

答︰

  1. RT-PCR對miRNA進(jin)行定量驗證;
  2. miRNA過表達;
  3. 熒(ying)光素黴法,過表達miRNA測(ce)定靶(ba)基因表達量;把(ba)靶(ba)基因連上一(yi)個(ge)熒(ying)光素黴,如(ru)果靶(ba)基因表達量下(xia)降,可檢測(ce)到的熒(ying)光信號則減弱
  4. 降解組(zu)測(ce)序
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