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微生物(wu)多樣(yang)性技術介紹

微生物(wu)多樣(yang)性分(fen)析是以研究環境中(zhong)xing)?wu)的種(zhong)類(lei)和tui)課 康模 jie)示隨環境變化導致微生物(wu)群落結構變化的過(guo)程。其研究對象廣泛,包括土壤、水體、發(fa)酵液、植can)wu)表面、動物(wu)胃腸道(dao)、皮膚等。

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研究對象

實驗設計到信息分(fen)析一(yi)站(zhan)式服務

提供全面的微生物(wu)多樣(yang)性研究的方案設計和tui)酆蠓瘢 岣壞謀曜擠fen)析以及個(ge)性化分(fen)析多角度闡(chan)明(ming)環境微生物(wu)變化規律。

  • 方案確fan)/h3>

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技術策(ce)略(lue)與送(song)樣(yang)要(yao)求

?測序策(ce)略(lue)

Illumina Hiseq 2500 PE250測序

?DNA送(song)樣(yang)要(yao)求

DNA濃(nong)度?≧10ng/μl(Qubit),DNA質量≧500ng(Qubit),DNA電(dian)泳條帶清晰,無(wu)降(jiang)解(jie)或(huo)者輕度降(jiang)解(jie)。

環境樣(yang)品取樣(yang)方法及送(song)樣(yang)要(yao)求

糞便︰清晨采集新鮮糞便樣(yang)品,放于無(wu)菌(jun)離心管或(huo)其它無(wu)菌(jun)容器(qi)中(zhong),樣(yang)品帶回(hui)實驗室後分(fen)裝至無(wu)菌(jun)離心管或(huo)凍存管中(zhong),每(mei)份樣(yang)品5g左右即(ji)可,液氮速凍3-5min-80°C長期保存,干冰運輸(shu)送(song)樣(yang)。

腸道(dao)內(na)容物(wu)︰無(wu)菌(jun)條件下對動物(wu)個(ge)體進行處理,用75%酒精擦拭體表,用無(wu)菌(jun)解(jie)?? 剖剪剪開動物(wu)腹部,取出(chu)胃腸道(dao)等目的器(qi)官,用PBS進行清洗,離心收集沉澱,分(fen)裝于2 mL離心管中(zhong);迅速置于液氮中(zhong)冷凍 3~4 小時,然後轉移至-80°C 或(huo)液氮中(zhong)長期保存,干冰運輸(shu)。

土壤︰選取采樣(yang)地(di)點,可多點采樣(yang)法進行取樣(yang),除去土壤表層未分(fen)解(jie)的凋(diao)落物(wu)層,采集土壤5g左右;樣(yang)品帶回(hui)實驗室後過(guo)2mm 篩後;分(fen)裝至無(wu)菌(jun)EP管或(huo)凍存管中(zhong),迅速置于液氮中(zhong)冷凍 3~4 小時,然後轉移至-80°C 或(huo)液氮中(zhong)長期保存,干冰運輸(shu)。

污(wu)泥︰選取污(wu)泥樣(yang)本于無(wu)菌(jun)離心管或(huo)其它無(wu)菌(jun)容器(qi)中(zhong),樣(yang)品帶回(hui)實驗室後分(fen)裝至無(wu)菌(jun)離心管或(huo)凍存管中(zhong),每(mei)份樣(yang)品5g左右即(ji)可,液氮速凍3-5min-80°C長期保存,干冰運輸(shu)送(song)樣(yang)。

水體︰對于水質較為清澈(目測)的或(huo)微生物(wu)含(han)量極(ji)其稀少的水樣(yang)如︰自來水、井(jing)水、泉水等,用采集回(hui)來的水樣(yang)樣(yang)品 1L 通過(guo) 0.22μm 的微孔(kong)濾si)?嬋展(zhan)耍  yang)中(zhong)的總微生物(wu)被富集在濾si)?礱媯 四(si)?胛wu)菌(jun)管中(zhong),液氮速凍,干冰運輸(shu)。

發(fa)酵液︰對于水質較為混濁(zhuo)的(或(huo)微生物(wu)含(han)量較為豐富的發(fa)酵液)水樣(yang),三點水樣(yang)混合搖(yao)勻後取80mL分(fen)裝在兩(liang)個(ge)無(wu)菌(jun)的50mL的離心管,每(mei)個(ge)分(fen)裝40mL,防止分(fen)裝過(guo)滿,水樣(yang)冰凍後體積(ji)膨脹,導致離心管破(po)裂,被其它微生物(wu)群體污(wu)染。液氮速凍3-5 min-80℃保存。

皮膚︰采用無(wu)菌(jun)棉簽或(huo)無(wu)菌(jun)手(shou)術刀(dao)片輕輕刮(gua)取皮膚表面取樣(yang),取樣(yang)後將棉簽置于無(wu)菌(jun)的離心管,液氮速凍,-80℃長期保存;如果研究正(zheng)常情(qing)況下皮膚微生物(wu),取樣(yang)前24h不能洗澡(zao),不能使用潤膚乳及抗菌(jun)活(huo)性的肥皂(zao)等。

產品優勢(shi)與項目經驗

豐富的項目經驗與專業的信息團隊,提供全面準確的信息分(fen)析。

高水平分(fen)析團隊

豐富的項目經驗

全面的分(fen)析內(na)容

專業的售後服務

成功案例(li)

數據(ju)質控

數據(ju)下機(ji)後chan)ju)PE reads之(zhi)間的Overlap關系,將Hiseq測序得到jiang)乃 誦蛄惺ju)拼接(Merge)成一(yi)條序列Tags,同時對Reads的質量和Merge的效果進行質控,主要(yao)包括去除低質量Tags和去嵌合體

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物(wu)種(zhong)注釋(shi)

根據(ju)97%的相似度進行OTU聚(ju)類(lei)後,基于Silva(細菌(jun))和UNITE(真菌(jun))分(fen)類(lei)學數據(ju)庫對OTU進行分(fen)類(lei)學注釋(shi),得到每(mei)個(ge)OTU對應的物(wu)種(zhong)分(fen)類(lei)信息,進而在各水平(phylum,class,order,family,genus,species)統計各樣(yang)品群落組成,繪制樣(yang)品在各分(fen)類(lei)學水平下的群落結構柱狀圖(tu),柱狀圖(tu)展(zhan)示不同樣(yang)品fen)形(xing)鎦zhong)的組成和相對豐度。

主成分(fen)分(fen)析(Principal Component Analysis,PCA)

PCA是一(yi)種(zhong)分(fen)析和tu)蚧 ju)集的技術,通過(guo)將方差進行分(fen)解(jie),將多組數據(ju)的差ju)旆從吃詼 暉tu)上(shang),通過(guo)分(fen)析不同樣(yang)品 OTU(97%相似性)組成可以反映樣(yang)品的差ju)旌途 耄CA運用方差分(fen)解(jie),將多組數據(ju)的差ju)旆從吃詼 暉tu)上(shang),坐標軸取能夠(gou)最(zui)大反映方差的兩(liang)個(ge)特征值。圖(tu)中(zhong)兩(liang)個(ge)樣(yang)品距離越(yue)近(jin),則表示這兩(liang)個(ge)樣(yang)品的組成越(yue)相似。

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Alpha多樣(yang)性分(fen)析

Alpha多樣(yang)性(Alpha diversity)反映的是單個(ge)樣(yang)品內(na)部的物(wu)種(zhong)多樣(yang)性,有多種(zhong)衡量指標︰Chao1AceShannonSimpson。Chao1和Ace指數簡單的反映出(chu)群落中(zhong)xing)鎦zhong)的數量;Shannon和Simpson指數用于衡量群落多樣(yang)性,受樣(yang)品群落中(zhong)xing)鎦zhong)豐度和物(wu)種(zhong)均(jun)勻度(Community evenness)的影響。Chao1、Ace、Shannon指數值越(yue)大,Simpson指數值越(yue)小,說明(ming)樣(yang)品的物(wu)種(zhong)多樣(yang)性越(yue)高。另外還統計了樣(yang)本文庫的覆蓋率 Coverage,其數值越(yue)高,則樣(yang)本中(zhong)序列被測出(chu)的概率越(yue)高,而沒(mei)有被測出(chu)的概率越(yue)jiang)汀/p>

Beta多樣(yang)性分(fen)析

Beta多樣(yang)性分(fen)析主要(yao)采用 binary jaccardbray curtisweighted unifrac(限細菌(jun))、 unweighted unifrac (限細菌(jun))等4種(zhong)算法計算樣(yang)品間的距離從而獲得樣(yang)本間的β值。這四(si)個(ge)算法主要(yao)分(fen)為兩(liang)大類(lei)︰加權(Bray-Curtis和Weighted Unifrac)與非加權(Jaccard和Unweightde Unifrac)。利用非加權的計算方法,主要(yao)比較的是物(wu)種(zhong)的有xing)wu);而加權方法,則需要(yao)同時考慮(lv)物(wu)種(zhong)有xing)wu)和物(wu)種(zhong)豐度兩(liang)個(ge)問題。樣(yang)品間距離越(yue)小,說明(ming)兩(liang)個(ge)群體的物(wu)種(zhong)組成越(yue)相似。

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LEfSe分(fen)析

LEfSe(Line Discriminant Analysis (LDA) Effect Size)分(fen)析主要(yao)用于發(fa)現不同組間具有xing)臣蒲?鉅(ju)斕iomarker,根據(ju)設定的Biomarker篩選標準(LDA score>4)找出(chu)符(fu)合條件的Biomarker。

lefse_biomarkers_cladogram_less_strict

16S功能預測

16S功能預測基于PICRUSt軟件通過(guo)比對16S測序數據(ju)獲得的物(wu)種(zhong)組成信息,推測樣(yang)本中(zhong)的功能基因組成,從而分(fen)析不同樣(yang)本或(huo)分(fen)組之(zhi)間在功能上(shang)的差ju) /p>

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相關性分(fen)析

網(wang)絡圖(tu)是相關性yue) 囊yi)種(zhong)表現zhong)xing)式,根據(ju)各個(ge)物(wu)種(zhong)在各個(ge)樣(yang)品fen)械姆岫紉約氨浠 qing)況,使用sparcc算法進行相關分(fen)析,圖(tu)中(zhong)線的粗細代表相關性的強(qiang)弱;線的顏色(se)表示相關性︰han)hong)色(se)代表正(zheng)相關,綠色(se)代表負相關。

Q1.微生物(wu)多樣(yang)性中(zhong)OTU是指什麼?

OTU(Operational Taxonomic Unit )即(ji)分(fen)類(lei)操作單元,是在系統發(fa)生學研究或(huo)群體遺傳學研究中(zhong),為了便于進行分(fen)析,人為給(gei)某一(yi)個(ge)分(fen)類(lei)單元(品系,種(zhong),屬,分(fen)組等)設置的同一(yi)標志。在微生物(wu)多樣(yang)性分(fen)析中(zhong),根據(ju)不?同的相似度水平,對所有序列進行OTU劃分(fen),一(yi)般情(qing)況下,如果序列之(zhi)間的相似性高于97%?(種(zhong)水平)就可以把它定義(yi)為一(yi)個(ge)OTU,每(mei)個(ge)OTU代表一(yi)個(ge)物(wu)種(zhong)。

Q2.Beta多樣(yang)性四(si)種(zhong)距離算法的差ju)歟/span>

Beta 多樣(yang)性分(fen)析主要(yao)采用 binary jaccard bray curtis unweighted Unifrac(限細菌(jun))weighted Unifrac (限細菌(jun))4種(zhong)算法計算樣(yang)品間的距離,那麼這四(si)種(zhong)算法都有什麼差別(bie)呢(ne)?

非加權的計算方法,主要(yao)考慮(lv)的是物(wu)種(zhong)的有xing)wu),即(ji)如果兩(liang)個(ge)群體的物(wu)種(zhong)類(lei)型(xing)都jia)yi)致,表示兩(liang)個(ge)群體的樣(yang)本距離最(zui)小;加權方法,則同時考慮(lv)物(wu)種(zhong)有xing)wu)和物(wu)種(zhong)豐度兩(liang)個(ge)問題。比如如樣(yang)品A3個(ge)物(wu)種(zhong)a2個(ge)物(wu)種(zhong)b組成,樣(yang)品B2個(ge)物(wu)種(zhong)a3個(ge)物(wu)種(zhong)b組成,則通過(guo)非加權方法計算,因為樣(yang)品A與樣(yang)品B的物(wu)種(zhong)組成完全一(yi)致,都只由物(wu)種(zhong)ab組成,因此它們之(zhi)間的樣(yang)本距離為0。但通過(guo)加權方法計算,雖然樣(yang)品A與樣(yang)品B的物(wu)種(zhong)組成一(yi)致,但物(wu)種(zhong)ab的數目卻不同,因此兩(liang)個(ge)群體的β多樣(yang)性則並(bing)非一(yi)致。

基于獨立OUT的方法認為OTU之(zhi)間不存在進化上(shang)的聯(lian)系,每(mei)個(ge)OTU間的關系平jiang)齲換諳低撤fa)生樹計算的方法,會(hui)根據(ju)16s的序列信息對OTU進行進化樹分(fen)類(lei), 因此不同OTU之(zhi)間的距離實際上(shang)有“遠近(jin)”之(zhi)分(fen)。

Q3.PCA與PCoA的區別(bie)?

主成分(fen)分(fen)析(Principal Component Analysis,PCA)是一(yi)種(zhong)分(fen)析和tu)蚧 ju)集的技術,通過(guo)將方差進行分(fen)解(jie),將多組數據(ju)的差ju)旆從吃詼 暉tu)上(shang);主坐標分(fen)析法(Principal coordinates analysis,PCoA)是一(yi)種(zhong)與 PCA 類(lei)似的降(jiang)維排序方法。PCoA與PCA的區別(bie)在于PCA是基于原(yuan)始的物(wu)種(zhong)組成矩陣所做的分(fen)析,使用的是歐式距離,僅僅比較的是物(wu)種(zhong)豐度的不同,而PCoA首先根據(ju)不同的距離算法計算樣(yang)品fen) 淶木 耄 緩蠖躍 刖卣蠼寫 恚 雇tu)中(zhong)點間的距離正(zheng)好等于原(yuan)來的差ju)焓ju),實現定性數據(ju)的定量kong) 弧/span>

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