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DNA甲基(ji)化是重要(yao)的表觀遺(yi)傳學標(biao)記信息,獲得全(quan)基(ji)因組範duan) 謁位點的甲基(ji)化水平數據,對表觀遺(yi)傳學的時空特異(yi)性研究具有重要(yao)意(yi)義(yi)。Bisulfite甲基(ji)化測序(xu)是以新一代高通量測序(xu)平台為基(ji)礎(chu),結合全(quan)基(ji)因組Bisulfite處理(li)和生物(wu)信息數據分析技(ji)術,進行低成本、高效率(lv)、高準確度(du)的全(quan)基(ji)因組DNA甲基(ji)化水平圖譜(pu)繪制(zhi)。

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堿基(ji)類型分布

堿基(ji)類型分布ji)觳橛糜詡觳庥形wu)AT、GC分離現象(xiang)。若無(wu)bisulfite處理(li),高通量所測序(xu)列為基(ji)因組隨(sui)機打斷後的DNA片段(duan),由于位點在基(ji)因組上的分布是近似均(jun)勻的,同時,G/C、A/T含量也是近似均(jun)勻的。全(quan)基(ji)因組甲基(ji)化項目中經過bisulfite處理(li)後的mu)蜃櫓寫蟛糠值位點變成T位點,因此(ci)其中一條鏈出現T的含量增加而(er)C的含量劇減,同時對應(ying)的反向鏈出現A的含量增加而(er)G的含量減少。

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5mC檢測

5mC的檢測主要(yao)使用Bismark軟件工具包實現。由于樣品經過重亞硫酸(suan)處理(li),基(ji)因組上所有的未甲基(ji)化的C位點轉換成了U;經過PCR擴增U->T;即基(ji)因組上未甲基(ji)化的C轉化成了T;而(er)原本甲基(ji)化的C;沒(mei)有改變;相應(ying)的負鏈G->A;bismark是專門(men)用于甲基(ji)化處理(li)的比(bi)對軟件;他會對reads進行轉變;根(gen)據Clean Reads在參考基(ji)因組的最佳的比(bi)對yue)  ti)取(qu)全(quan)基(ji)因組胞嘧啶(ding)(C)位點的比(bi)對堿基(ji)信息,最終得到5mC位點覆蓋統計。

染(ran)色(se)體水平甲基(ji)化分布圖譜(pu)

在每條染(ran)色(se)體上,以100K大小為一窗口來計算每個窗口的甲基(ji)化水平,繼而(er)從染(ran)色(se)體水平描述(shu)甲基(ji)化 C 堿基(ji)的分布情(qing)況,繪制(zhi)全(quan)基(ji)因組染(ran)色(se)體水平甲基(ji)化圖譜(pu),可(ke)以很(hen)直觀的mou)氏殖鋈ran)色(se)體某(mou)個區(qu)域甲基(ji)化水平。

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高甲基(ji)化CGI區(qu)域注釋

對高甲基(ji)化密度(du)的CGI區(qu)域進行注釋,區(qu)域甲基(ji)化水平大于0.7我們認(ren)為是高甲基(ji)化的CGI區(qu)域;同時我們把覆蓋度(du)大于5X的C位點認(ren)為是可(ke)信度(du)較高的位點,去除CGI 區(qu)域內可(ke)信度(du)較高的C位點的比(bi)例小于0.1的CGI區(qu)域;對剩下的區(qu)域進行注釋;取(qu)基(ji)因上游3000bp為promoter區(qu),進行overlap注釋。

DMR相關GO基(ji)因分類注釋

DMR相關基(ji)因GO注釋分類統計圖,直觀的反映出在生物(wu)過程(cheng)(biological process)、細胞組分(cellular component)
和分子功能(molecular function),所有xie)蠔筒鉅(ju)旎ji)因注釋GO term的個數分布。可(ke)深入挖掘(jue)DMR相關基(ji)因的功能及所在的信號通路,篩選關注差ju)旎ji)因注釋情(qing)況。

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DMR關聯(lian)基(ji)因代謝(xie)通路分析

生物(wu)體內,某(mou)些基(ji)因位點受到甲基(ji)化修飾之後,會影(ying)響(xiang)該mei)ji)因的表達,從而(er)改變生物(wu)學表型。因此(ci),對DMR關聯(lian)基(ji)因分別進行GO和KEGG注釋及富集分析,有助(zhu)于深入挖掘(jue)甲基(ji)化修飾引起的生物(wu)學功能變化。

1. 每個DMR區(qu)的片段(duan)長度(du)不同是為什麼?例如一個DMR長度(du)將(jiang)近1 kb,那這(zhe)1 kb是怎麼來的,這(zhe)1 kb的任意(yi)一段(duan)是不是就不是DMR了?

答︰.DMR是用Bisulfighter軟件檢測的,詳細可(ke)以yuan)慰isulfighter的相關文獻(Bisulfighter:accuratedetectionofmethylatedcytosinesanddifferentiallymethylatedregions)。DMR是差ju)旒諄ji)化區(qu)域,長度(du)不固定,長度(du)為1KB的DMR中的任意(yi)一段(duan)不一定是DMR,如果取(qu)得的任意(yi)一段(duan)沒(mei)有甲基(ji)化的差ju)煬筒皇MR,如果有多個DMR連在一起,我們便將(jiang)這(zhe)些DMR合並成一個大的DMR。

2. 甲基(ji)化水平計算方法(fa)都有哪些?

答︰甲基(ji)化水平計算方法(fa)共分四(si)種(zhong)︰
1)單個位點甲基(ji)化水平︰
單個位點的甲基(ji)化水平=支(zhi)持甲基(ji)化C的reads數/總的reads數
注︰ 對于參考基(ji)因組上的C位點,有些reads(reads上此(ci)位置處是C)支(zhi)持此(ci)位點是甲基(ji)化的C位點,有些reads不支(zhi)持(reads上此(ci)位置是T), 那麼單個位點的甲基(ji)化水平就是支(zhi)持甲基(ji)化的reads數/(支(zhi)持甲基(ji)化的reads數+不支(zhi)持甲基(ji)化的reads數)
計算得到單個位點的甲基(ji)化水平後,我們用二(er)項分布ji)煆yan)判(pan)斷某(mou)位點是否為甲基(ji)化C位點。
用從左開始第二(er)個C計算單個位點甲基(ji)化水平。
對于某(mou)個區(qu)域的甲基(ji)化水平計算方法(fa),不同的方法(fa)會得到不同的結果。
2)區(qu)域甲基(ji)化水平計算方法(fa)1-Fraction of methylated cytosines
即︰甲基(ji)化C佔(zhan)區(qu)域內所有覆蓋到的C位點的比(bi)例
對于圖片中的a:區(qu)域甲基(ji)化水平=10/12;b)甲基(ji)化水平=11/12
3)區(qu)域甲基(ji)化水平計算方法(fa)2-Mean methylation level
即:所有C位點的平均(jun)甲基(ji)化水平,區(qu)域內所有甲基(ji)化的C的單個位點甲基(ji)化水平之和/區(qu)域內所有覆蓋到的C位點的個數
a)甲基(ji)化水平=(2/2+3/3+20/21+4/30+4/25+3/17+3/20+6/7+4/6+5/5)/12
b)甲基(ji)化水平=(1/5+1/3+3/12+40/41+29/31+30/32+77/87+45/47+4/12+1/7+2/10)/12
4)區(qu)域甲基(ji)化水平計算方法(fa)3-Weighted methylation level
即︰加權甲基(ji)化水平,區(qu)域內所有甲基(ji)化C位點總的reads數/區(qu)域內總的覆蓋度(du)
a)甲基(ji)化水平=(2+3+20+4+4+3+3+6+4+5)/(2+3+21+30+25+17+20+7+6+5+18+25)
b)甲基(ji)化水平=(1+1+3+40+29+30+77+45+4+1+2)/(5+3+12+16+41+31+32+87+47+12+7+10

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