一分快三

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ONT全長(chang)轉錄(lu)組(zu)測序(xu)是指基(ji)于牛津(jin)納米孔公(gong)司(Oxford Nanopore Technologies,ONT)三代測序(xu)平台進行全長(chang)轉錄(lu)組(zu)測序(xu)。

全長(chang)轉錄(lu)組(zu)測序(xu)(full-length transcriptome sequencing),又稱Isoform Sequencing(Iso-Seq),無需打(da)斷,基(ji)于三代測序(xu)平台直接獲取轉錄(lu)本的(de)5到3高質量全長(chang)序(xu)列,便于檢測轉錄(lu)本結構(gou)變異(yi)。

基(ji)于nanopore三代測序(xu)平台進行全長(chang)轉錄(lu)組(zu)測序(xu),除(chu)了可準(zhun)確鑒別轉錄(lu)本結構(gou)變異(yi),還可準(zhun)確定量轉錄(lu)本(mRNA或(huo)polyA+ lncRNA)表達(da)水平。

技術(shu)路線

真核生物(wu)中約95%轉錄(lu)本具有可變剪(jian)接、65%具可變起始位(wei)點,以及70%以上(shang)轉錄(lu)本具有可選(xuan)擇性多聚腺 酸(suan)APA現象,另外(wai)基(ji)因(yin)融合(he)也是一種癌癥(zheng)驅動因(yin)素,這些(xie)表明(ming)轉錄(lu)本結構(gou)變異(yi)是調(diao)節基(ji)因(yin)表達(da)多樣性和產生蛋(dan)白質多樣性的(de)重要原因(yin)。

產品參數

建庫策(ce)略數據量產品周期樣本要求
polyA nanopore全長(chang)轉錄(lu)組(zu)文庫6Gb clean data以上(shang)3個月總量︰≧3ug常(chang)規; 完整性︰RIN值(zhi)>8

應用方向

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3
lncRNA預(yu)測分析
4
轉錄(lu)本和基(ji)因(yin)差異(yi)表達(da)分析
1
可變剪(jian)接分析-AS
2
可選(xuan)擇性多聚腺 酸(suan)化分析-APA

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nanopore全長(chang)轉錄(lu)組(zu)測序(xu)與二代Illumina平台普通轉錄(lu)組(zu)的(de)區別?

主(zhu)要在于測序(xu)平台不同。Illumina平台主(zhu)要是PE150測序(xu),構(gou)建小(xiao)片(pian)段文庫,為(wei)邊(bian)合(he)成邊(bian)測序(xu),在建庫以及測序(xu)過(guo)程中均需要PCR擴增,主(zhu)要用于基(ji)因(yin)水平表達(da)定量及差異(yi)表達(da)分析。nanopre全長(chang)轉錄(lu)組(zu)測序(xu)無需打(da)斷RNA,可獲得5’到3’全長(chang)轉錄(lu)本序(xu)列及其(qi)表達(da)信(xin)息,對片(pian)段大小(xiao)無偏好,直接檢測電信(xin)號(hao)無需邊(bian)合(he)成邊(bian)測序(xu)其(qi)GC偏好性遠低于二代平台;同時由于無需拼接其(qi)在轉錄(lu)本層面的(de)結構(gou)變異(yi)檢測方面,比如可變剪(jian)接、融合(he)基(ji)因(yin)、APA、新基(ji)因(yin)預(yu)測等具有絕對優勢。

nanopore全長(chang)轉錄(lu)組(zu)測序(xu)送樣要求?

樣品類型︰PolyA RNA;樣品濃(nong)度︰≧50 ng/ul(Qubit HS RNA定量); 樣品總量︰cDNA-direct方式(shi)︰>250ng(單次);總量>750 ng;(若提(ti)供總RNA,動物(wu)樣品總量需按照(zhao)PolyA RNA要求的(de)100倍以上(shang)準(zhun)備); cDNA-PCR方式(shi)︰>1μg(單次);總量>3μg 樣品純(chun)度︰OD260/280 ~2.0,OD260/230在2.0-2.2 之間,260nm處有正常(chang)峰值(zhi);樣品無基(ji)因(yin)組(zu)DNA污染; 總RNA完整性︰ RIN值(zhi)≧8.0,28S/18S≧1.0;圖譜基(ji)線無上(shang)抬;5S峰正常(chang)。

nanopore全長(chang)轉錄(lu)組(zu)測序(xu)一般建議多少(shao)個生物(wu)學(xue)重復?

研究表明(ming),生物(wu)學(xue)重復chun)商ti)高所(suo)有xie)yin)表達(da)水平鑒定的(de)準(zhun)確性,而增加測序(xu)深度主(zhu)要提(ti)高低表達(da)基(ji)因(yin)表達(da)量鑒定準(zhun)確性。每(mei)種處理條件下至少(shao)3個生物(wu)學(xue)重復,當研究樣本的(de)生物(wu)學(xue)差異(yi)比較高,或(huo)者想研究更多的(de)微小(xiao)表達(da)差異(yi)/fold change時,需要更多生物(wu)學(xue)重復。也就是,比如對于個體差異(yi)較大的(de)臨(lin)床樣本可以5-10個/組(zu)以上(shang),而生物(wu)學(xue)差異(yi)較小(xiao)的(de)細胞系(xi)樣本則每(mei)組(zu)3個生物(wu)學(xue)重復以上(shang)即chun)傘/p>

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