全長比較(jiao)轉錄jia)/h1>
PHYLOTRANSCRIPTOME

全長比較(jiao)轉錄jia)椋hylotranscriptome)

基(ji)于轉錄jia)椴廡虻娜 ?冉jiao)轉錄jia)槭峭 dui)同一科、屬內(na)不同物(wu)種,尤其是復雜的或(huo)者無(wu)參(can)考基(ji)因組的物(wu)種,提取(qu)mRNA後進行(xing)PacBio三代測序,從基(ji)因序列水(shui)平研究起源于共同祖(zu)先的不同物(wu)種間的nan)低撤 叵狄約胺只 奔淶冉 錄煌 蓖wa)掘明顯受到正向選擇或(huo)者負向選擇的基(ji)因,從而快速(su)、全面地揭示選擇和適應機制。通過二代測序對(dui)三代序列進行(xing)校(xiao)正後,不需(xu)要組裝即得(de)到了(liao)高質量(liang)的全長轉錄本,從而避(bi)免了(liao)由于拼(pin)接引入的錯(cuo)誤,分析更精(jing)準。

三代全長比較(jiao)轉錄jia)櫚奶氐/span>

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二代與三代轉錄jia)櫫暾zheng)性(xing)比較(jiao)

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材料選擇

有共同祖(zu)先的科、屬內(na)不同物(wu)種

每科屬內(na)典(dian)型材料1-2個即可(ke)

每個個體不同組織(zhi)樣(yang)品混合xi) Vzheng)mRNA來(lai)源的全面性(xing),獲得(de)盡可(ke)能多的轉錄本。

文庫構建

二代測序︰二代轉錄jia)樾Σpian)段(duan)文庫。

三代測序︰1-2K;2-3K;>3K。

樣(yang)品要求

三代測序要求︰

樣(yang)品類型︰總RNA、組織(zhi)樣(yang);

樣(yang)品濃度︰總RNA濃度qu)00?ng/ul;

樣(yang)品體積(ji)︰>?10?ul;

樣(yang)品總量(liang)︰總RNA用量(liang)>?3?ug?;

樣(yang)品純度︰OD260/280為(wei)7~2.5,OD260/230為(wei)0.5~2.5,260nm處有正常(chang)峰值;

RNA完整(zheng)性(xing)︰總RNA的非植can)IN值≧8.0,植can)IN值≧7.5;28S/18S≧1.3;圖(tu)譜基(ji)線無(wu)上抬;5S峰正常(chang)。

 

二代測序要求︰

總RNA電(dian)泳28s和18s條帶(dai)清晰,且28s亮度大(da)于18s的兩倍(bei),5s條帶(dai)亮度越弱越好。

樣(yang)品濃度︰≧40?ng/μl(Qubit檢(jian)測)

樣(yang)品總量(liang)︰≧3μg(Qubit檢(jian)測)

樣(yang)品體積(ji)︰≧10μl

樣(yang)品純度︰OD260/280為(wei)7~2.5,OD260/230為(wei)0.5~2.5

RNA完整(zheng)性(xing)︰植can)IN值≧5,非植can)IN值≧7.0;28S/18S≧1;圖(tu)譜基(ji)線無(wu)上抬;5s峰較(jiao)低。

成(cheng)功案例

全長轉錄jia)槭/strong>

某復雜多倍(bei)體無(wu)參(can)物(wu)種︰
Hiseq測序平台;4G轉錄jia)槭br />PacBio測序平台;全長轉錄jia)br />結果(guo)對(dui)比︰三代全長獲得(de)的轉錄本更長、更全。

2
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系統發育樹

用muscle軟件將獲得(de)的每個直系同源基(ji)因的氨基(ji)酸序列進行(xing)比對(dui),然後將所有直系同源基(ji)因的比對(dui)結果(guo)合並,使用jModelTest?2軟件進行(xing)模(mo)型選擇,根據模(mo)型選擇結果(guo),用PhyML軟件進行(xing)似然樹的構建,獲得(de)各(ge)個種間的nan)低辰 鰲/p>

分化時間估算

構建進化樹後,如有外群(qun)和化石標定時間,可(ke)以用PAML軟件的mcmctree方法(fa)計算各(ge)個物(wu)種的分化時間。如無(wu)法(fa)提供外群(qun)和化石標定時間,可(ke)以根據T=Ks/2r估計兩兩物(wu)種的分化時間,其中r為(wei)中xing)xing)突變率(lv),可(ke)以查閱(yue)nan)喙匚南(nan)茲範 /p>

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ka-ks

基(ji)于Ka/Ks的選擇壓力分析

Ka/Ks或(huo)者dN/dS表示的是非同義突變頻(pin)率(lv)(Ka)和同義突變頻(pin)率(lv)(Ks)之間的比例。一般認為(wei),同義突變不受自然選擇,而非同義突變則受到自然選擇作用。通過比較(jiao)非同義替換率(lv)和同義替換率(lv)的nan)嘍dui)比值可(ke)以確定這個基(ji)因在(zai)進化中受到的選擇壓力,即判斷是否有選擇壓力作用于這個蛋白(bai)質編碼基(ji)因。

做(zuo)全長比較(jiao)轉錄jia)櫚囊庖/span>

1、從基(ji)因水(shui)平來(lai)開展對(dui)某chang)ㄐ ┤wu)種的研究是最直接、最有xing)? 鉅撞cao)作的途徑,而通過轉錄jia)椴廡蚴腔竦de)基(ji)因的最為(wei)成(cheng)熟的手段(duan);
2、對(dui)于不同物(wu)種,尤其是無(wu)參(can)考基(ji)因組或(huo)參(can)考基(ji)因組不完善pin)耐 豢剖裟na)不同種的進化地位的確定,可(ke)通過直系同源基(ji)因來(lai)實現;
3、對(dui)于基(ji)因組很復雜,或(huo)者同一科屬內(na)物(wu)種差別大(da),無(wu)法(fa)通過重測序進行(xing)分析;
4、無(wu)需(xu)構建群(qun)體,研究對(dui)象(xiang)為(wei)單(dan)獨的物(wu)種。

2代測序數據在(zai)全長比較(jiao)轉錄jia)櫸治鮒械撓τ檬鞘裁矗/span>

2代數據主要是對(dui)3代數據進行(xing)糾lai)cuo),從而可(ke)以獲得(de)更多有xing)?代數據,來(lai)進行(xing)全長轉錄本的分析;另外,二代轉錄jia)槭蓴箍ke)以通過表達量(liang)的差異(yi)用于驗證(zheng)那些受到正選擇的基(ji)因。

全長比較(jiao)轉錄jia)櫸治瞿na)容(rong)能發表什麼水(shui)平的文章(zhang)?

目前依賴二代的轉錄jia)槭萁xing)比較(jiao)轉錄jia)櫸治齙奈南(nan)子瀉芏啵 綺葺  fan)茄(qie),昆蟲等,早期發表文章(zhang)IF比較(jiao)高,例如番(fan)茄(qie)(2013?PANS),昆蟲(2014 Science),而全長比較(jiao)轉錄jia)櫸治鱟魑wei)一種新技ji)躒qu)解析物(wu)種間進化關系,除了(liao)自身的準確性(xing)及優勢外,作為(wei)新技ji)醺rong)易協助研究者發高層次文章(zhang),目前利用全長比較(jiao)轉錄jia)櫸 淼奈惱zhang)幾(ji)乎沒有xiao)渙磽猓  ?冉jiao)轉錄jia)槲wu)需(xu)實驗驗證(zheng),可(ke)快速(su)產出文章(zhang)。

為(wei)什麼全長比較(jiao)轉錄jia)椴蛔zuo)與表達量(liang)相關的分析?

(1)不同物(wu)種,多拷貝基(ji)因難以確定基(ji)因的一?一對(dui)應關系無(wu)法(fa)比較(jiao)表達量(liang);當(dang)然,單(dan)拷貝同源基(ji)因可(ke)以確定一一對(dui)應關系,但是;

(2)表達譜差異(yi)分析(例如?RPKM值dang)冉jiao)xi)┤導ji)上使用的內(na)參(can)是?RNA總量(liang)。相同物(wu)種RNA總量(liang)穩定,所以沒有問題。但不同物(wu)種RNA總量(liang)未必相同,所以物(wu)種間的差異(yi)分析就(jiu)失去(qu)了(liao)穩定的內(na)參(can)。因此強(qiang)行(xing)比較(jiao)的話,是不嚴(yan)謹的。

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