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轉錄(lu)組(zu)測序的研究對(dui)象(xiang)為特定細(xi)胞在某一(yi)huai)δ蘢刺 濾蘢 lu)出來的所有(you)mRNA。轉錄(lu)組(zu)測序能夠(gou)從整(zheng)體(ti)水平研究基因表(biao)達(da)量以及基因結構,揭示(shi)特定生(sheng)物學過程中的分(fen)子機理;目前已(yi)廣(guang)泛應用(yong)于基礎研究、臨床診斷、藥物研發(fa)和tou)fen)子育種等領域(yu)。

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數據質(zhi)控

為確保Reads有(you)足夠(gou)高的質(zhi)量,將下機原始測序數據(raw reads)去掉含有(you)帶接頭(tou)的、低質(zhi)量的reads,得(de)到clean reads,保證後續分(fen)析的準確性。測序因受測序儀本身、測序試劑、樣品等因素影(ying)響,存在一(yi)定的錯誤率。堿基測序錯誤率分(fen)布圖可以反映測序數據的質(zhi)量。

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參考序列比(bi)對(dui)

將Clean Reads與參考基因組(zu)進行序列比(bi)對(dui),獲取在參考基因組(zu)或基因上(shang)xi)奈恢眯畔xi),定位區域(yu)分(fen)為Exon(外顯子)、Intron(內含子)
和Intergenic(基因間區)。比(bi)對(dui)到參考基因組(zu)上(shang)xi)eads稱為Mapped Reads,Mapped Reads佔Clean Reads的百(bai)分(fen)比(bi),可以評估(gu)所選參考基因組(zu)組(zu)裝是(shi)否能滿足信息(xi)分(fen)析的需求(qiu)。

基因表(biao)達(da)水平分(fen)析

生(sheng)物學重復的相關(guan)性不僅可以檢驗生(sheng)物學實驗操作的可重復性,還(huai)可以評估(gu)差異表(biao)達(da)基因的可靠性和輔助異常樣品的篩(shai)查。

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重復相關(guan)性評估(gu)

生(sheng)物學重復的相關(guan)性不僅可以檢驗生(sheng)物學實驗操作的可重復性,還(huai)可以評估(gu)差異表(biao)達(da)基因的可靠性和輔助異常樣品的篩(shai)查。

差異表(biao)達(da)基因分(fen)析

差異表(biao)達(da)基因以火山(shan)圖、MA圖、韋恩圖、聚類熱圖、蛋白互作圖等形式呈現,通過火山(shan)圖(Volcano Plot)可以快(kuai)速地查看基因在兩(liang)個(ge)(組(zu))樣品fen)斜biao)達(da)水平的差異,以及差異的統計(ji)學顯著性。對(dui)于有(you)生(sheng)物學重復的樣本,我們采用(yong)DEseq進行樣品組(zu)間的差異表(biao)達(da)分(fen)析,獲得(de)兩(liang)個(ge)生(sheng)物學條件之間的差異表(biao)達(da)基因集;對(dui)于沒有(you)生(sheng)物學重復的樣本,使用(yong)EBseq進行差異分(fen)析。篩(shai)選差異基因標準一(yi)般(ban)為︰Fold Change≧2,FDR<0.01。

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差異表(biao)達(da)基因聚類分(fen)析

聚類分(fen)析用(yong)于判(pan)斷差異基因在不同實驗條件下的表(biao)達(da)模式,可通過將表(biao)達(da)模式jiao)嗤 螄嘟幕蚓奐 cheng)類,從而(er)識別未(wei)知基因的功能或已(yi)知基因的未(wei)知功能,同類基因可能具有(you)相似的功能或共同參與同一(yi)代(dai)謝huai)獺/p>

差異表(biao)達(da)基因GO分(fen)類

差異表(biao)達(da)基因GO注釋tou)fen)類統計(ji)圖,直觀的反映出在生(sheng)物過程(biological process)、細(xi)胞組(zu)分(fen)(cellular component)
和tou)fen)子功能(molecular function),所有(you)基因和差異基因注釋GO term的個(ge)數分(fen)布。可深入(ru)挖掘差異基因的功能及所在的信號通路,篩(shai)選關(guan)注差異基因注釋情況。

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差異表(biao)達(da)基因蛋白互作網絡

STRING收錄(lu)多個(ge)物種預測的和實驗驗證的蛋白質(zhi)-蛋白質(zhi)互作的數據庫,包括(kuo)直接的物理互作和間接的功能相關(guan)。結合差異表(biao)達(da)分(fen)析結果(guo)和數據庫收錄(lu)的互作關(guan)系(xi)對(dui),構建(jian)差異表(biao)達(da)基因互作網絡。

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Q1. 在轉錄(lu)組(zu)的三個(ge)重復測序中,不是(shi)所有(you)基因的的可變剪接都(du)會出現3次,有(you)的出現1次或2次,這種情況如何判(pan)定該基因是(shi)否存在相應的剪接方式?

答︰針對(dui)每個(ge)樣品,同一(yi)個(ge)基因的不同轉錄(lu)本會存在可變剪接,我們只(zhi)是(shi)根據測序的實dao)適荻dui)可變剪接進行預測,而(er)不是(shi)進行驗證;如果(guo)要判(pan)斷是(shi)否存在相應的剪接方式,需要實驗去驗證。重復實驗存在一(yi)定的差異,會導(dao)致可變剪接的不同。

Q2. 轉錄(lu)組(zu)結果(guo)與基因組(zu)比(bi)對(dui)後,沒有(you)相應的注釋結果(guo),我們認(ren)為是(shi)New genes。但是(shi),在NCBI注釋後,有(you)些基因的注釋結果(guo)顯示(shi)是(shi)參考基因組(zu)物種,這種zhi)蚧huai)能算(suan)是(shi)new genes嗎?

答︰我們分(fen)析流程中是(shi)將測序的Reads比(bi)對(dui)到參考基因組(zu),然後進行拼接,其中一(yi)些reads比(bi)對(dui)到基因間區並且能拼接出完整(zheng)的開放閱讀框,拼接出來的位于基因間區的這些基因即(ji)為新基因。預測得(de)到的新基因才會進行功能注釋,所以注釋結果(guo)與新基因的判(pan)斷沒有(you)關(guan)系(xi)。

Q3︰生(sheng)物學重復樣品fen)心掣ge)樣品與其他相關(guan)性不太好該怎麼處理?會不會影(ying)響文章發(fa)表(biao)?

答︰為了確保分(fen)析結果(guo)的準確性,老師通常會設置3個(ge)生(sheng)物學重復,這樣就可能出現生(sheng)物學重復中某個(ge)樣品相關(guan)性不好的情況,影(ying)響後續差異分(fen)析結果(guo)的準確性。通常可shan) 麼 磣zu)中相關(guan)性不好的樣品剔除,再進行差異分(fen)析。後期可通過RT-qPCR等試驗手段彌(mi)補生(sheng)物學重復的不足,不會影(ying)響文章的發(fa)表(biao)。

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