全長轉錄jia)椴廡/h1>

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全長轉錄jia)檠芯渴搶斫jie)生物機(ji)體功能(neng)的一個重要(yao)途(tu)徑。傳統二代轉錄jia)椴廡蛭wu)法直接獲得單個RNA分子由5到3的全部序列(lie)。基(ji)于PacBio三代測序平台的轉錄jia)檠芯浚 wu)需(xu)打斷(duan),直接讀取反轉錄的全長cDNA,能(neng)夠有效的獲取高質量的單個RNA分子的全部序列(lie),準確辨別二代測序無(wu)法識別的同源(yuan)異構體(isoform)、同源(yuan)基(ji)因、超家族(zu)基(ji)因或等(deng)位基(ji)因表達的轉錄本。

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測序reads展示(shi)

全長轉錄jia)椴捎玫?腫郵(you)凳輩廡蚣ji)術,通過構建(jian)啞鈴型文庫,以環形(xing)方式循(xun)環測序。為了避免(mian)測序過程中(zhong)對短片(pian)段偏好性,保(bao)證不同長度轉錄本的覆蓋度,會(hui)按(an)照轉錄本長度分開建(jian)庫。通過對各文庫測序所得reads長度統計,評估各文庫構建(jian)質量。

3-reads
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ROI 序列(lie)長度分布

下機(ji)原始數據通過數據處(chu)理去(qu)除啞鈴型接頭部分,每個單分子ZMW里(li)插入序列(lie)的最高質量序列(lie)即為ROI序列(lie),ROI數量是評估測序好壞(huai)的一個指(zhi)標。ROI序列(lie)長度與建(jian)庫時的cDNA長度選擇有關,ROI序列(lie)隨cDNA長度的增加而增加。

可(ke)變(bian)剪接分析

基(ji)因轉錄生成(cheng)的前體mRNA(pre-mRNA),有多種zhi)艚臃絞劍 ≡癲煌 耐庀宰櫻 煌 某cheng)熟mRNA,從而翻譯(yi)為不同的蛋白質,構成(cheng)生物性狀的多樣性。這種轉錄後(hou)的mRNA加工過程稱(chen)為可(ke)變(bian)剪接或選擇性剪接(Alternative splicing)。可(ke)變(bian)剪接類(lei)型包括︰(A) 外顯子跳(tiao)躍;(B) 可(ke)變(bian)轉錄終止位huai)悖C) 可(ke)變(bian)外顯子;(D) 可(ke)變(bian)轉錄起始位huai)悖E) 內含子保(bao)留。百邁客使用Astalavista軟件獲取每個樣品存在(zai)的可(ke)變(bian)剪接類(lei)型。

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轉錄本NR注釋

Nr數據庫是NCBI中(zhong)的非冗(rong)余蛋白質數據庫,包含了Swissprot、PIR(Protein Information Resource)、PRF(Protein Research Foundation)、PDB(Protein Data Bank)蛋白質數據庫及an)enBank和(he)RefSeq的CDS數據翻譯(yi)過來的蛋白質數據信(xin)息。通過序列(lie)比(bi)對尋(xun)找同源(yuan)物種,並進行注釋。

轉錄本GO注釋

GO數據庫是GO組織(Gene Ontology Consortium)于2000年構建(jian)的一個結構化的標準生物學注釋系di)常 zhi)在(zai)建(jian)立基(ji)因及其產物知識的標準詞匯體系,適用于各個物種。GO注釋系di)呈且桓 邢蛭wu)環圖,包含三個主要(yao)分支,即:生物學過程(Biological Process),分子功能(neng)(Molecular Function)和(he)細胞組分(Cellular Component)。

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轉錄本KEGG注釋

在(zai)生物體內,不同的基(ji)因產物相互協調來行使生物學功能(neng),對表達基(ji)因的通路(Pathway)注釋分析有助于進一步解(jie)讀基(ji)因的功能(neng)。KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)是系di)撤治齷ji)因功能(neng)、基(ji)因組信(xin)息數據庫,它有助于研究者把基(ji)因及表達信(xin)息作(zuo)為一個整體網絡進行研究。

全長轉錄jia)椴廡蛑zhong),為什麼要(yao)建(jian)3個以上文庫?

答︰全長轉錄jia)椴捎玫?腫郵(you)凳輩廡蚣ji)術,通過構建(jian)啞鈴型文庫,以環形(xing)方式循(xun)環測序。測序時bao) 唐pian)段文庫更容易落入零模波導孔(kong)。為了避免(mian)測序過程中(zhong)短片(pian)段文庫偏好性,保(bao)證不同長度轉錄本的覆蓋度,因此,會(hui)構建(jian)3個或3個以上文庫。

全長轉錄jia)櫓zhong)ROI,subread, FLNC分別指(zhi)什麼?

答︰ROI(Reads of Insert)︰指(zhi)每個單分子測序反應器ZMW里(li)插入序列(lie)的最高質量序列(lie)

Subread︰每個聚(ju)合黴序列(lie)(polymerase read)被分zhi)ge)成(cheng)的一個或多個子序列(lie)(Subread)

FLNC(Full-Length non-chimericRead)︰全長非嵌合序列(lie),即兩端同時含有3’引物和(he)5’引物,及3’引物前含有polyA尾(wei)的非人(ren)工嵌合序列(lie)。

建(jian)庫過程中(zhong)因接頭fang) 然MRTbell濃度過低(di)造(zao)成(cheng)兩個cDNA模板鏈(lian)直接相連而生成(cheng)的嵌合序列(lie)稱(chen)為人(ren)工嵌合序列(lie)

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