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2020年02月20日,國際知名期刊Nature Communications (《自(zi)然?通訊》)在(zai)線發(fa)表了由華中師範大學與北京百(bai)邁客生物科技有限公(gong)司共同合xian)魑惱隆enomic and transcriptomic insights into molecular basis of sexually dimorphic nuptial spines in Leptobrachium leishanense”。華中師範大學生科院吳華教授為本文通訊作者,華中師範大學生科院李軍博士為論文的(de)第一(yi)作者,百(bai)邁客生物科技作為第二單位共同參與研究。本研究借助二代、三代PacBio和HiC技術組裝了我國特(te)有物種(zhong)雷山髭蟾(chan)(Leptobrachium Leishanense)高(gao)質(zhi)量基(ji)因組,通過比較基(ji)因組學分(fen)析及an)菩xiong)個體不同發(fa)育時(shi)期的(de)有參轉錄組分(fen)析鑒定(ding)了一(yi)系列(lie)與角質(zhi)刺性(xing)二態(tai)發(fa)育相(xiang)關的(de)生物學通路和關鍵基(ji)因。研究成(cheng)果(guo)首(shou)次較全面地解析了兩棲(qi)動物性(xing)二態(tai)形成(cheng)相(xiang)關的(de)重要生物學通路以及關鍵基(ji)因,彌補了相(xiang)關研究的(de)不足。該成(cheng)果(guo)不僅為兩棲(qi)動物基(ji)因組數據庫(ku)提(ti)供了高(gao)質(zhi)量的(de)參考基(ji)因組,而且對于深(shen)入理解脊椎(zhui)動物性(xing)二態(tai)形成(cheng)及調控的(de)分(fen)子機制具有重要意義(yi)。

研究背景

在(zai)雌雄(xiong)異體的(de)有性(xing)生物中,兩性(xing)之(zhi)間在(zai)體型大小、形態(tai)結構(gou)和功能等(deng)方面存(cun)在(zai)明(ming)顯差異的(de)現象(xiang)稱為性(xing)二態(tai)(Sexual dimorphism)。自(zi)然界普遍存(cun)在(zai)的(de)性(xing)二態(tai)(如(ru)劍尾魚的(de)劍狀尾和獅子的(de)鬃毛等(deng))一(yi)直是進化生物學家關注的(de)熱點(dian)問(wen)題。兩棲(qi)動物具有豐富的(de)性(xing)二態(tai)特(te)征,繁殖期的(de)雄(xiong)性(xing)雷山髭蟾(chan)在(zai)上頜的(de)皮膚形成(cheng)角質(zhi)刺,類似于人類的(de)“胡(hu)子”,因此又被稱為“胡(hu)子蟾(chan)”,繁殖期過後(hou),角質(zhi)刺外(wai)殼會脫落(luo),而雌性(xing)則沒(mei)有這種(zhong)特(te)征。由于除了性(xing)染色體上的(de)基(ji)因外(wai),大多數的(de)基(ji)因組在(zai)雄(xiong)性(xing)和雌性(xing)之(zhi)間是共享(xiang)的(de),所以性(xing)二態(tai)往往是由基(ji)因在(zai)性(xing)別(bie)間差異性(xing)表達引起(qi)的(de)。由于缺(que)乏參考基(ji)因組,很少有研究能夠將性(xing)別(bie)差異表達模式與特(te)定(ding)的(de)性(xing)二態(tai)特(te)征聯(lian)系起(qi)來,與性(xing)二態(tai)性(xing)狀相(xiang)關的(de)重要生物學過程和關鍵基(ji)因也一(yi)直難以破ping)狻1疚某cheng)功的(de)建立了一(yi)個具有代表性(xing)的(de)鋤(chu)足蟾(chan)亞目(mu)基(ji)因組,並對其(qi)皮膚來源的(de)性(xing)二態(tai)性(xing)狀進行了分(fen)子基(ji)礎的(de)研究。

研究材料

基(ji)因組(Illumina、PacBio測序)︰成(cheng)熟雄(xiong)性(xing)雷山髭蟾(chan)肌肉組織(zhi)
HiC︰成(cheng)熟雄(xiong)性(xing)雷山髭蟾(chan)全血
轉錄組基(ji)因預測︰腦、精巢、肝、心、腎、脾、肌肉、上頜皮膚(MS)、背部(bu)皮膚(DS)
轉錄組學分(fen)析︰亞成(cheng)年期、繁殖期、繁殖後(hou)期雌性(xing)及雄(xiong)性(xing)的(de)上頜皮膚、背部(bu)皮膚、腦、性(xing)腺組織(zhi)(圖1)
qPCR驗證︰雌性(xing)及雄(xiong)性(xing)繁殖期上頜皮膚、背部(bu)皮膚。

圖1 雷山髭蟾(chan)雌雄(xiong)外(wai)形特(te)征及取(qu)樣示例

分(fen)析內容

1、雷山髭蟾(chan)基(ji)因組的(de)組裝注釋及結構(gou)特(te)征分(fen)析
2、與其(qi)他六種(zhong)無尾兩棲(qi)類的(de)比較基(ji)因組分(fen)析
3、兩種(zhong)性(xing)別(bie)和三個發(fa)育階段(duan)多組織(zhi)的(de)比較xian) 甲櫸fen)析及qPCR驗證
4、兩種(zhong)性(xing)別(bie)和三個發(fa)育階段(duan)的(de)基(ji)因共表達分(fen)析

主要結果(guo)

1. 雷山髭蟾(chan)基(ji)因組的(de)組裝注釋及結構(gou)特(te)征分(fen)析
k-mer分(fen)布估計基(ji)因組大小為3.56 Gb(k=21,圖2)。通過PacBio(~80×)+Illumina(~50X)+Hi-C(~44X)技術組裝出3.54 Gb基(ji)因組,並將3.31 Gb(92.9%)基(ji)因序列(lie)定(ding)位到(dao)13條(tiao)染色體上,contig N50為1.93 Mb,scaffold N50為395 Mb(表1,圖3)。CEGMA評估顯示組裝基(ji)因組中包含的(de)保守(shou)基(ji)因佔97.2%,BUSCO評估顯示組裝基(ji)因組中完整基(ji)因數佔97.2%,表明(ming)組裝的(de)基(ji)因組具有較高(gao)的(de)完整性(xing)。雷山髭蟾(chan)具有77.1%(2.73Gb)的(de)重復(fu)序列(lie),高(gao)于大多數已完成(cheng)測序的(de)無尾目(mu)物種(zhong)(表1)。本次研究獲得了鋤(chu)足蟾(chan)亞目(mu)代表性(xing)物種(zhong)染色體水平(ping)基(ji)因組的(de)組裝。

圖2 k-mer分(fen)布圖

圖3 Hi-C交互信號

表1 雷山髭蟾(chan)與其(qi)它無尾目(mu)物種(zhong)基(ji)因組比較

通過基(ji)因組共線性(xing)研究雷山髭蟾(chan)L. leishanense和熱que) chan)?X. tropicalis的(de)基(ji)因組結構(gou)特(te)征。結果(guo)表明(ming),兩個物種(zhong)之(zhi)間存(cun)在(zai)著(zhou)大量的(de)染色體共線性(xing)(圖4 b)。L. leishanense染色體數目(mu)是13,而?X. tropicalis的(de)染色體數目(mu)是10,這種(zhong)差異是源于L. leishanense的(de)染色體分(fen)裂(lie)。X. tropicalis染色體(Xtr)4、7和8上的(de)同源共線性(xing)區段(duan)分(fen)布在(zai)L. leishanense基(ji)因組中的(de)兩個獨立染色體上(分(fen)別(bie)為Lle8+10、6+11和9+13)。在(zai)L. leishanense的(de)基(ji)因組中,346個共線性(xing)區段(duan)中有179個倒位。經(jing)PacBio reads驗證,X. tropicalis的(de)Xtr2、3、6、9、10等(deng)7個區域(502 Kb-5.9 Mb)易位到(dao)與相(xiang)應同源染色體不同的(de)L. leishanense染色體上(圖5)。

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圖4? 雷山髭蟾(chan)與其(qi)它無尾目(mu)物種(zhong)基(ji)因組比較

圖5 HiC互作信號鑒定(ding)雷山髭蟾(chan)染色體倒位
2.?與其(qi)他六種(zhong)無尾目(mu)動物的(de)比較基(ji)因組分(fen)析
通過單拷貝直系同源基(ji)因進行進化樹的(de)構(gou)建,七個無尾目(mu)物種(zhong)最近的(de)共同祖先(MRCA)估計發(fa)生在(zai)2.101億年前(176.2-248.8 Ma),L. leishanense與新蛙亞目(mu)的(de)物種(zhong)在(zai)約185.9 Ma發(fa)生分(fen)化(圖6)。與MRCA相(xiang)比,L. leishanense共有107個基(ji)因家族顯著擴張(圖6),擴張家族的(de)基(ji)因主要富集于信號反(fan)應類型,包括嗅覺、刺激(ji)反(fan)應和信號轉導。與細胞(bao)增殖、凋亡(wang)和存(cun)活等(deng)多種(zhong)細胞(bao)功能的(de)調節和對細胞(bao)外(wai)刺激(ji)的(de)反(fan)應中起(qi)重要作用的(de)PI3K-Akt信號通路在(zai)L. leishanense中顯著擴張。與免疫反(fan)應相(xiang)關生物過程相(xiang)關基(ji)因發(fa)生顯著且特(te)異性(xing)的(de)擴張。還需要進一(yi)步的(de)分(fen)析和實驗數據來探討其(qi)生境適應與免疫應答相(xiang)關基(ji)因擴張的(de)關系。
圖6?無尾目(mu)動物比較基(ji)因組分(fen)析
在(zai)擴張的(de)基(ji)因家族中,兩個編(bian)碼中間絲(si)(Intermediate Filament, IF)蛋白zhui)幕ji)因家族在(zai)L. leishanense基(ji)因組中顯著擴張(圖6)。這兩種(zhong)擴張的(de)基(ji)因家族包括編(bian)碼角蛋白zhui)幕ji)因,角蛋白是上皮細胞(bao)的(de)成(cheng)絲(si)蛋白,參與脊椎(zhui)動物角質(zhi)化組織(zhi)的(de)形成(cheng),如(ru)人的(de)頭發(fa)和指甲。在(zai)哺乳動物中,表皮堅硬組織(zhi)的(de)一(yi)個重要組成(cheng)部(bu)分(fen)zhi)橇嚼唳角蛋白(稱為Ⅰ型和Ⅱ型α-角蛋白),基(ji)因組分(fen)析表明(ming)人類共有54個功能性(xing)角蛋白基(ji)因(28個Ⅰ型和26個Ⅱ型),分(fen)別(bie)聚集在(zai)兩條(tiao)染色體上。在(zai)L. leishanense中,共鑒定(ding)出101個完整的(de)α-角蛋白基(ji)因,包括53個I型和48個II型基(ji)因,這遠遠高(gao)于在(zai)其(qi)他物種(zhong)中觀(guan)察到(dao)的(de)此類基(ji)因的(de)數量。通過比較α-角蛋白基(ji)因的(de)基(ji)因組分(fen)布,發(fa)現Ⅰ型和Ⅱ型α-角蛋白基(ji)因分(fen)別(bie)聚集在(zai)L. leishanense的(de)兩條(tiao)染色體(Lle 12和Lle 2)上,而且側翼(yi)基(ji)因與其(qi)它脊椎(zhui)動物的(de)基(ji)因相(xiang)同,暗示角蛋白基(ji)因序列(lie)的(de)保守(shou)性(xing)。在(zai)哺乳動物(人和小鼠)和L. leishanense及其(qi)他無尾目(mu)動物中,存(cun)在(zai)多個物種(zhong)特(te)異性(xing)的(de)角蛋白基(ji)因簇(cu),這是角蛋白基(ji)因庫(ku)擴大的(de)主要原因(圖7a)。L. leishanense中發(fa)生串聯(lian)復(fu)制的(de)角蛋白基(ji)因與哺乳動物的(de)毛發(fa)角蛋白(Hair Keratins, HKs)同源(圖7a)。L. leishanense中HK同源基(ji)因的(de)拷貝數幾乎(hu)是其(qi)他無尾類的(de)兩倍(圖7a)。

為了進一(yi)步探討高(gao)重復(fu)HK基(ji)因與L. leishanense?SD角質(zhi)刺的(de)相(xiang)關性(xing),研究者對表達的(de)RNAs(RNA-seq)進行了測序,並比較了HK和非HK基(ji)因在(zai)多個樣本中的(de)表達模式。研究發(fa)現,L. leishanense中的(de)I型和II型重復(fu)HK基(ji)因在(zai)繁殖期(B)雄(xiong)性(xing)MS中表現出雄(xiong)性(xing)偏向性(xing)和MS特(te)異性(xing)的(de)高(gao)表達,而非HK基(ji)因在(zai)兩性(xing)MS和DS中的(de)表達相(xiang)似(圖7?b)。這些(xie)結果(guo)表明(ming)IF基(ji)因家族的(de)擴張,特(te)別(bie)是高(gao)度重復(fu)的(de)HK基(ji)因,與L. leishanense角質(zhi)刺的(de)發(fa)生緊密(mi)相(xiang)關。
圖7 角蛋白基(ji)因家族的(de)基(ji)因組分(fen)布和表達模式
3. 兩種(zhong)性(xing)別(bie)和三個發(fa)育階段(duan)多組織(zhi)的(de)比較xian) 甲櫸fen)析及qPCR驗證
為了sou)芯.leishanense中與角質(zhi)刺性(xing)二態(tai)相(xiang)關的(de)生物學過程,研究人員對MS的(de)轉錄組進行了兩種(zhong)性(xing)別(bie)和三個發(fa)育階段(duan)的(de)測序(表2)。同時(shi)對兩種(zhong)性(xing)別(bie)和三個階段(duan)的(de)DS轉錄本作為對照。對于每個發(fa)育階段(duan),進行了三組獨立比較(圖1)︰(1)雄(xiong)性(xing)和雌性(xing)MS的(de)比較;(2)雄(xiong)性(xing)MS與DS的(de)比較;(3)雌性(xing)MS與DS的(de)比較。確定(ding)差異表達基(ji)因(DEGs),並進行了GO和KEGG的(de)富集,以檢查基(ji)本的(de)生物學過程和途(tu)徑。
表2?轉錄組分(fen)析組織(zhi)代號
亞成(cheng)年期(A),雄(xiong)性(xing)MS和DS之(zhi)間的(de)差異表達基(ji)因(DEGs)主要參與轉錄調控過程和骨骼發(fa)育相(xiang)關過程,而在(zai)雌性(xing)中類似的(de)生物學過程tang)揮蟹fa)生富集繁殖期(B),兩性(xing)MS中差異表達基(ji)因大多富集在(zai)激(ji)素活性(xing)和上皮細胞(bao)分(fen)化過程,雄(xiong)性(xing)MS和DS之(zhi)間的(de)DEGs也有類似的(de)生物過程富集,但在(zai)相(xiang)同的(de)雌性(xing)比較中卻(que)沒(mei)有;繁殖後(hou)期(C),雄(xiong)性(xing)MS和DS的(de)DEGs在(zai)含有多個編(bian)碼胰(yi)蛋白黴和組織(zhi)蛋白黴基(ji)因的(de)蛋白水解過程中顯著富集,可(ke)能是通過蛋白水解過程來引起(qi)角質(zhi)刺脫落(luo)。

圖8?雷山髭蟾(chan)中與角質(zhi)刺產生相(xiang)關顯著富集的(de)生物過程

為了探討L.?leishanense中角質(zhi)刺的(de)激(ji)素調節,研究者對來自(zi)大腦和性(xing)腺的(de)轉錄組數據進行了測序(表2)。研究發(fa)現B期雄(xiong)性(xing)和雌性(xing)之(zhi)間的(de)DEGs(BM3-BF3)和A期和B期雄(xiong)性(xing)之(zhi)間的(de)DEGs(AM3-BM3)中的(de)神經(jing)活性(xing)配(pei)體-受(shou)體相(xiang)互作用途(tu)徑顯著富集,在(zai)這些(xie)基(ji)因中,LH(黃(huang)體生成(cheng)素)和FSH(卵泡刺激(ji)素)編(bian)碼 (tai)激(ji)素,通過血液進入性(xing)腺刺激(ji)類固(gu)醇激(ji)素的(de)合成(cheng)(圖9)。相(xiang)關基(ji)因的(de)表達表明(ming)雄(xiong)性(xing)在(zai)繁殖季(ji)節中下(xia)丘腦-垂gu)性(xing)腺軸的(de)激(ji)活。雄(xiong)性(xing)精巢在(zai)不同時(shi)期的(de)類固(gu)醇激(ji)素生物合成(cheng)途(tu)徑顯著豐富。在(zai)這條(tiao)途(tu)徑中,編(bian)碼參與性(xing)類固(gu)醇生物合成(cheng)的(de)黴的(de)基(ji)因在(zai)B期雄(xiong)性(xing)精巢中高(gao)度que)澩錚ㄍ),表明(ming)B期雄(xiong)性(xing)精巢中雄(xiong)激(ji)素(睪酮(tong)和5α-DHT)生物合成(cheng)水平(ping)較高(gao)。

除了性(xing)腺外(wai),皮膚是主要的(de)非經(jing)典組織(zhi),通過功能性(xing)活性(xing)黴的(de)表達促進類固(gu)醇生成(cheng)。在(zai)L. leishanense中,雄(xiong)性(xing)和雌性(xing)MS之(zhi)間的(de)DEG也在(zai)類固(gu)醇生物合成(cheng)過程中顯著富集。這些(xie)黴的(de)高(gao)表達表明(ming)雄(xiong)性(xing)MS中雄(xiong)激(ji)素C19類固(gu)醇的(de)積(ji)累(lei)。然而,單靠雄(xiong)激(ji)素不足以支持(chi)雄(xiong)性(xing)的(de)性(xing)二態(tai)特(te)征,其(qi)他激(ji)素也起(qi)著(zhou)關鍵作用。研究發(fa)現,甲狀腺激(ji)素(TH),催乳素(PRL)和松弛素(RLN)可(ke)能參與調節過程。“甲狀腺激(ji)素轉運(thyroid hormone transport)”在(zai)BM2–BF2和BM1-BM2的(de)DEGs中高(gao)度富集(圖8)。

圖9?腦和性(xing)腺成(cheng)對比較中顯著富集的(de)激(ji)素相(xiang)關途(tu)通路
4.?兩種(zhong)性(xing)別(bie)和三個發(fa)育階段(duan)的(de)基(ji)因共表達分(fen)析
為了進一(yi)步確定(ding)控制ping)侵zhi)刺生長的(de)關鍵基(ji)因,研究者分(fen)析了基(ji)因共表達網絡,並使用加權基(ji)因共表達網絡分(fen)析(WGCNA)鑒定(ding)了基(ji)因模塊(genetic module),試(shi)圖找出與特(te)定(ding)性(xing)狀相(xiang)關的(de)模塊(可(ke)能表現出相(xiang)同生物活性(xing)的(de)高(gao)度相(xiang)關基(ji)因)。共表達網絡揭示了Wnt通路、角蛋白基(ji)因krt、黑(hei)色素合成(cheng)相(xiang)關的(de)酪(lao)氨酸黴基(ji)因tyr以及轉錄因子hoxc13等(deng)參與形成(cheng)角質(zhi)刺結構(gou)(圖10)。
圖10 WGCNA分(fen)析基(ji)因共表達模塊和網絡

小結

本文以雷山髭蟾(chan)為研究對象(xiang),建立了一(yi)個具有代表性(xing)的(de)鋤(chu)足蟾(chan)亞目(mu)基(ji)因組。這項研究不僅提(ti)供了一(yi)個高(gao)質(zhi)量的(de)兩棲(qi)動物基(ji)因組,並揭示了雷山髭蟾(chan)角質(zhi)刺產生的(de)分(fen)子基(ji)礎。對于深(shen)入理解脊椎(zhui)動物性(xing)二態(tai)形成(cheng)及調控的(de)分(fen)子機制具有重要意義(yi),類似的(de)分(fen)子調控模式也為今後(hou)兩棲(qi)動物皮膚起(qi)源的(de)性(xing)二態(tai)研究提(ti)供指導。

 

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