十分快三

2020年02月20日,Nanopore平台全新測序芯片(pian)R10到達百邁客實驗室,百邁客將開啟ONT平台測序新征程!

近年來,由于三代測序相較于二代測序,擁有(you)單分子無需擴增(zeng),長(chang)度(du)長(chang)等絕對優(you)勢,因此(ci)在各組學研究中大(da)放(fang)異彩。而(er)作為三代測序的代表技(ji)術(shu)之(zhi)一,Nanopore平台因能獲得更長(chang)讀長(chang),在基(ji)因組學研究中更是(shi)備受青睞。但相較于二代平台,三代平台測序數(shu)據(ju)的準確性一直是(shi)比(bi)較大(da)的劣勢。本次Oxford Nanopore Technologies公司即將推出的R10芯片(pian),則劍指(zhi)準確性。相較于當前廣泛使用的R9.4.1芯片(pian),新型R10芯片(pian)可提供相當的讀長(chang),產量(liang)及更準確的數(shu)據(ju)。

R10芯片(pian)測序原理(li)

新升級R10芯片(pian)最大(da)的更新是(shi)納米(mi)孔采(cai)用了雙讀取器(Reader)的設計,能夠(gou)對同一堿(jian)基(ji)進(jin)行(xing)兩次信(xin)號識(shi)別(bie)。理(li)論上,同一堿(jian)基(ji)的識(shi)別(bie)次數(shu)為R9.4.1版本芯片(pian)2倍,由此(ci)來增(zeng)加堿(jian)基(ji)的判斷率,減(jian)小隨機錯誤,並提高一致準確性。R10與R9.4.1測序方式比(bi)較如(ru)圖1

圖1??測芯片(pian)更新lv)昂蟛廡蚍絞獎bi)較
R10數(shu)據(ju)準確性到底如(ru)何(he)呢,目(mu)前的信(xin)息具體(ti)如(ru)下︰

01、單reads測序準確性︰

目(mu)前主流的R9.4.1芯片(pian)的表現(xian)能力如(ru)何(he)?我們(men)隨機抽取了200個(ge)已經完成常規ONT DNA測序的樣品(包含各種動植物(wu))進(jin)行(xing)統計,總共(gong)約22.4T數(shu)據(ju)(足夠(gou)有(you)代表性了),結果(guo)如(ru)下︰

可以看到,R9.4.1芯片(pian)數(shu)據(ju)的讀長(chang)是(shi)非常理(li)想(xiang)的︰Reads N50最高達到72 Kb,平均達到35 Kb;最長(chang)單分子讀長(chang)達到了1.6 Mb;而(er)關于質(zhi)量(liang)值(zhi)平均為8.3,對應準確性為︰85.21%;最高單個(ge)樣品平均質(zhi)量(liang)值(zhi)達到9.7,對應準確性為︰89.28%;

R10的質(zhi)量(liang)表現(xian)如(ru)何(he)呢?我們(men)統計了si)na)到的四(si)個(ge)樣品的數(shu)據(ju),具體(ti)統計結果(guo)見下圖︰

圖2 R10數(shu)據(ju)質(zhi)量(liang)值(zhi)分布

絕大(da)部分R10 reads的質(zhi)量(liang)值(zhi)達到了10以上(對應準確性為90.0%),而(er)平均質(zhi)量(liang)值(zhi)為12.1(對應準確性為93.8%),而(er)最高reads質(zhi)量(liang)值(zhi)已經達到了15以上(對應準確性為96.84%)。由此(ci)可見,對于單條reads來ci)擔 嶸故shi)非常明顯的,平均reads準確性從85%提升到了93.8%。

02、Consensus序列準確︰

看完單條reads準確性後,那麼(me)組裝時用到的高深度(du)consensus序列準確性怎麼(me)樣呢?官方比(bi)較了song) 謊靜煌 酒pian)測結果(guo)的準確性,見圖3。從結果(guo)可知,相同測序深度(du)的情況下,consensus後序列的準確性Q值(zhi),R10比(bi)R9.4.1提升了5~10之(zhi)間(jian),對應的準確性最高提升了1個(ge)百分zhi)恪/p>

圖3?不同物(wu)種中R10和R9.4.1 reads準確度(du)

從官方的數(shu)據(ju)顯示,當數(shu)據(ju)深度(du)ren)0X時,R10測序數(shu)據(ju)的consensus序列的準確性已經達到了Q44,即99.996%以上(圖4)。且(qie)隨著測序深度(du)的增(zeng)加,R10芯片(pian)一致準確性逐漸增(zeng)加yin)9俜蕉遠轡wu)種測試發現(xian),在100X的測序深度(du)下,consensus準確性可以保持在Q45以上,在有(you)xing)┬舊仙踔zhi)已達到Q50(99.999%)水平(圖4),當bi)患喲da)測序深度(du)也可以想(xiang)要(yao)達到更高水平,測試結果(guo)中,最高已經達到了Q52(99.9994%)。需要(yao)注意的是(shi),這都是(shi)未(wei)經過二代測序數(shu)據(ju)矯正的結果(guo)!

圖4 ?不同測序深度(du)下R10 consensus序列準確性比(bi)較
03、同聚物(wu)識(shi)別(bie)準確性︰

同聚物(wu)的識(shi)別(bie)準確性是(shi)大(da)家一直都比(bi)較關心的問題,從ONT官方釋放(fang)的測試結果(guo)顯示,相比(bi)于R9.4.1,R10版本芯片(pian)能夠(gou)顯著提高其(qi)在同聚物(wu)區域的堿(jian)基(ji)識(shi)別(bie)準確度(du),並且(qie)幾(ji)乎(hu)不會(hui)引入缺(que)失錯誤(圖5)。

圖5 R10、R9.4.1芯片(pian)在同聚物(wu)區域的測序準確度(du)
04、數(shu)據(ju)錯誤分布︰

官方通過檢(jian)測同一樣本R10和R9.4.1中的錯誤在基(ji)因組上的情況,發現(xian)R9.4.1與R10的錯誤在基(ji)因組上分布並不是(shi)完全重疊的,通過兩種版本芯片(pian)的數(shu)據(ju)進(jin)行(xing)混合(he)分析,可極大(da)地提高序列的準確性(圖6)。這表明了,在不使用二代數(shu)據(ju)的前提下,後續也可考慮(lv)通過R10和R9.4.1數(shu)據(ju)組合(he)的方式來提高結果(guo)的準確度(du)!

圖6?R10和R9.4.1錯誤分布情況

小結

全新R10芯片(pian)在設計上采(cai)用了信(xin)號雙識(shi)別(bie)的策略,與R9.4.1芯片(pian)相比(bi),有(you)xing) 嶸 夾蛄校  畚wu)區域及Consensus序列準確性。在不使用二代數(shu)據(ju)的情況下,結合(he)R9.4.1及R10的數(shu)據(ju),可獲得更高的準確性!目(mu)前R10芯片(pian)全球還處于小試研發階段,如(ru)果(guo)一切順利,三季度(du)即可大(da)規模商用,敬請期待!

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